来源：BioArtMED

人类内耳是自然界中最精密的器官之一，以螺旋状耳蜗为特点，它由一系列有序的听觉感觉细胞，以及复杂的前庭器官组成。内耳的复杂形态是在胎儿发育期由一系列错综复杂的信号事件组成的，具有高度协调且高保真性。目前全世界有近10%的成年人有中度到严重的听力损失，但出生时的听力损失发生率只有不到0.2%。这意味着绝大多数的神经性听力损失是由成体发育中的原始内耳细胞功能障碍造成的。随着耳机等音乐设备的出现，越来越多成年人出现更为严重的中度至重度听力损失。 

耳解剖结构，来源：Unity asset store

听觉功能下降是一个全球性的公共卫生问题，WHO的数据,全世界有4.6亿人受到听力下降的影响，其中90%以上的人群属于低收入和中等收入国家。在65岁的老年人中，有30%以上的人受到听力损伤的影响。此外，每年有超过100万新生儿出生时存在听力功能障碍，超过1.4亿青少年（12-35岁）由于长时间使用耳机而暴露于高音量的音乐和娱乐活动中，受到听力损伤的影响。这些数据表明，听力受损已经成为全世界范围内的一个常见的公共卫生问题，需要我们采取行动来进行改善。近年来，随着研究的深入，干细胞在多个疾病的研究和治疗领域中展现出了不错的前景。同样，在听觉治疗的研究领域也取得了许多新的进展。

为了在体外重现人类内耳发育的复杂过程，2023年7月6日，美国印第安纳大学Eri Hashino研究组在Cell Stem Cell发表题为“Generating high-fidelity cochlear organoids from human pluripotent stem cells”的研究论文，通过人类诱导多能干细胞建立了高保真性耳蜗类器官。

耳蜗中的机械敏感毛细胞负责听力，但是容易受到基因突变和环境损伤。由于人类耳蜗组织研究样本的缺乏，对人类耳蜗组织以及其中毛细胞的研究变得非常困难。类器官的出现则为耳蜗组织的研究提供了重要平台。

为了监测体外培养中人类诱导多能干细胞衍生耳蜗祖细胞和毛细胞的效率，作者们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了PAX2-2A-nGFP/POU4F3-2A-ntdTomato的双色报告因子。PAX2 是耳蜗祖细胞早期标记物，而POU4F3则是高度特异性的分化毛细胞标记物，可以用于确定耳蜗类器官培养效率（图1）。

图1 表达PAX2-2A-nGFP/POU4F3-2A-ntdTomato双色报告因子的耳蜗类器官

研究团队所建立类器官的平台一定程度上依赖人类诱导多能干细胞的自我诱导分化，与之前报道的内耳类器官实验方案类似 [3-6]。为了进一步优化培养系统从而可以持续产生毛细胞以及前庭表型，作者们对耳蜗组织发育中的关键因子进行分析。Sonic Hedgehog（SHH）以及WNT信号通路在耳蜗结构的发育中发挥了关键作用。因此，研究团队在诱导方案中顺序加入小分子SHH激动剂PUR以及WNT抑制剂IWP2，结果发现能够促进内耳类器官的腹侧化（图2）。

图2 优化耳蜗类器官实验方案

随后，研究团队对内耳类器官进行单细胞RNA测序，总共收集了37073个细胞，对耳蜗细胞标记物进行分析并确定了诱导培养方案的有效性。研究发现，PUR+IWP2的处理会促进人内耳类器官耳祖细胞的腹侧化。另外，通过标记物的免疫染色，研究团队发现腹侧化的内耳类器官中表达毛细胞标记物。扫描电镜的结果也表明所建立耳蜗类器官表现出毛细胞的结构特征，电生理学的研究也发现类器官表达外毛细胞标记物PRESTIN且具有耳蜗外毛细胞特有的电压门控电流特征。

图3 耳蜗类器官工作模型

科学家利用iPSCs的3D培养技术,尝试寻找耳蜗复制的关键分化线索。研究者发现wnt信号转导促进了基因在生物祖细胞中的表达。随后,脑室化的祖细胞分化成上皮细胞，其形态、标记表达和功能特性与耳蜗内和外毛细胞一致。这些结果表明iPSCs分化的祖细胞足以推动耳蜗感应器官的发育,并建立一个前所未有的系统来重建人的听觉器官。

研究者已经证明了SH和Wnt通路的精确的时间调节性赋予了腹侧耳型的多能性祖细胞,其中一些随后产生了具有结构性、转录性和功能性两种类型的耳蜗毛细胞，内、外毛细胞和成熟的毛细胞。体外培养的器官可以完全进入类同于人类胎儿发育第三个月的阶段。此外，SCRA-SEQ分析确定NR2F1是一个以前未被识别的关键转录途径，对耳蜗和前庭多样化必不可少。需要进一步的研究来阐明转录途径和结构发育之间交叉对话的机制,并建立一种控制内毛细胞和外毛细胞生成的方法。研究者在研究中所建立的耳蜗器官被认为是一个强大的人类模型,可应用于研究人类耳蜗发育的生物学，阐明遗传性听力丧失的发病机制，并确定治疗深度听力丧失的治疗靶点。

虽然当前干细胞治疗听力下降尚处于基础研究阶段，但随着更多研究项目的进一步推进，越来越多的有意义的数据在不断累积当中，相信在不久的将来，我们可以通过批量培育的人类耳蜗实现更加可靠的治疗，帮千万病患摘掉助听器，重回充满欢声笑语的正常生活。

总的来说，作者通过复制耳蜗组织发育的关键分化线索，通过顺序调节Sonic Hedgehog和WNT信号通路优化耳蜗类器官的诱导方案，促使耳蜗类器官中发育出形态各异的毛细胞并且具有标记物表达、结构特征以及电生理特征，实现了人类听觉系统的全面模拟，为内耳发育以及病理学研究提供了重要工具平台。