2024年9月11日，上海市东方医院(同济大学附属东方医院)干细胞基地再生医学研究所、同济大学生命科学与技术学院何志颖教授、张文成副研究员团队与美国北卡罗来纳大学教堂山分校(UNC-CH)Lola Reid教授团队在BioactiveMaterials上发表了题为“Hormonally andChemically Defined Expansion Conditions for Organoids of Biliary Tree StemCells”的研究论文。

研究团队成功构建了一个精确定义的BTSC(胆道干细胞)类器官扩增系统，该系统通过深入分析确定了BTSC类器官在体外扩增所需的关键微环境因素，并据此开发了一种名为BEX(Biliary tree stem cell expansion hydrogel system)的水凝胶扩增系统。该系统使得BTSC及其衍生的类器官数量得以千倍增长。这些扩增后的BTSC及其类器官不仅能够在体外分化成具有功能的肝细胞，而且在体内，通过研究团队先前开发的干细胞补片移植技术，能够有效治疗肝衰竭模型小鼠。这一系统的建立为BTSC在临床治疗中的应用提供了大量且功能完备的干细胞资源。

01 人胆管树干细胞

人胆管树干细胞(biliary tree stem cells,BTSC)是位于肝内、外和胰外胆管树壁内胆管周腺(peribiliary tree glands,PBG)内干细胞龛中的肝/胰腺共祖干细胞。

在器官的发育和再生过程中，BTSC具有分化成多种干细胞亚群的能力。一方面，它们能够分化为位于赫林管内或附近的肝干细胞(hepatic stem cells, HpSC)及其后代肝母细胞(hepatoblast, HBs)，从而参与肝脏的再生过程。另一方面，BTSC也能通过分化为位于肝/胰腺总导管的PBG中的胰腺干细胞，进而参与胰腺的再生。这些特性使得BTSC在临床应用中具有重要的潜力，为肝脏和胰腺功能损伤的修复提供了新的治疗策略。

02 研究步骤

该研究成功建立了BEX体系，实现了BTSC及其类器官的体外大量扩增。

研究团队通过对比BTSC与成熟肝实质细胞的转录组图谱，精确识别了维持BTSC干性的关键信号通路，包括Hippo、PI3K/AKT、MAPK和Ras等。

结合之前对胚胎干细胞(ESC)和胃上皮细胞来源的内胚层干细胞的研究，研究者们筛选出一系列小分子化合物，如0.5μM Bix01294、2μM Bay K8644、0.04μM RG108、2μM SB431542、10μM毛喉素和1μM A83-01等，以及生长因子或旁分泌信号如50 ng/mL EGF、100 ng/mL R-Spondin1(RSPO1)、100 ng/mL Noggin和50 ng/mL Wnt3a等，共同构成了10因子-确定增殖培养基(10-Defined-Proliferative-Medium, 10-DPM)。这一培养基成功实现了原代BTSC的扩增，7天内扩增达20倍。进一步研究表明，10-DPM不仅能有效维持BTSC的传代扩增，而且在结合水凝胶(如Matrigel或透明质酸-肝素水凝胶)的三维扩增体系下，能够获得BTSC类器官，并实现长期扩增传代。

RG 108、A8301、Forskolin、BAY 8644对于mBTSC的扩张至关重要

在对10-DPM进行组合优化筛选的研究中，结果证实了在所有小分子化合物中，DNA甲基化酶抑制剂RG108、TGFβ信号通路抑制剂A83-01、cAMP激动剂毛喉素、以及钙离子通道激动剂Bay K8644组成的4-DPM是原代BTSC扩增的必要组分。然而，缺少Wnt信号通路的激活配体RSPO1时，BTSC的传代和类器官形成以及持续传代的能力会明显受到影响。补充RSPO1后构成的5-DPM，在促进原代BTSC增殖、BTSC二维扩增以及BTSC类器官形成和长期扩增维持方面的能力与10-DPM相当，从而证实了Wnt信号通路在BTSC扩增和BTSC类器官形成中的关键作用。

基于水凝胶的三维扩增体系相较于传统的二维培养条件，展现出显著的优势。在5-DPM作为扩增培养基的条件下，水凝胶预处理的二维体系仅能在有限的代次内维持BTSCs的属性。相对而言，BTSC类器官在5-DPM条件下能够稳定传代超过20代，并在60天内实现超过3000倍的细胞扩增。此外，通过对比二维和三维条件下扩增的BTSCs的转录组图谱分析，发现三维扩增体系能显著减少细胞增殖过程中产生的DNA损伤，为细胞提供了二维单层培养所缺乏的损伤保护。这些结果强调了三维培养体系在维持BTSCs扩增和功能方面的重要性。

在确认了培养基后，研究进一步对水凝胶的成分进行了优化。与其他三维培养扩增研究相似，研究中首先借鉴了Hans Clevers等团队基于Matrigel的类器官形成和维持体系。Matrigel(康宁)主要由四种主要的基底膜成分组成，包括层粘连蛋白(约60%)、IV型胶原(约30%)、巢蛋白(约8%)和硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPGs)，尤其是串珠蛋白(约2~3%)。其他组分的生物学活性已经有大量研究，但其独立于蛋白多糖的糖胺聚糖尚未确定。通过结合BTSC体内微环境中的糖胺聚糖组分，并在透明质酸水凝胶中添加硫酸乙酰肝素及其蛋白多糖组分(HAHS)，成功地实现对Matrigel的替代。并最终与5-DPM结合，形成成分确定的BTSC类器官体外扩增的BEX体系。

与单层(2D)培养相比，作为类器官(3D)维持更好地提高了mBTSC对DNA损伤的抵抗力

该研究成功建立了BEX体系，实现了BTSC及其类器官的体外大量扩增。扩增后的BTSC不仅保持了肝向分化的潜能，而且在动物模型中展现出了救治肝衰竭的能力。这项工作为基于BTSC移植治疗肝衰竭的临床转化应用提供了一个稳定且高效的种子细胞制备体系，解决了BTSC获取和扩增的关键问题，为临床治疗提供了有力支持。